Si ve un mensaje de error de optimización de PCR o solución de problemas en su PC, consulte estos consejos para la solución de problemas.Muchos de los problemas más comunes con PCR y RT-PCR generalmente se detectan durante la electroforesis en gel de agarosa, que muestra los productos de cada reacción. Estos incluyen no tener ninguno de los productos de audio o mantenimiento esperados, la presencia de curas no específicas, manchas excesivas y la presencia de una nueva banda de dímero de imprimación.
La antigua PCR diagnostica problemas con cosas de reacción y, lo que es más importante, protocolos de amplificación y también ejecutando el gel. Temas relacionados: herramientas de PCR, reactivos de PCR, crecimiento del ensayo de PCR y, por lo tanto, optimización de PCR para el ensayo.
Paso cierto – Desnaturalización.Paso 2 – Resplandor.La nueva etapa es la expansión.Paso 4 2 . análisis de electroforesis.
Modelo para un laboratorio académico para producir kits cuantitativos de RT-PCR con el fin de evaluar el SARS-CoV-2.
Trabaja en un área elegida.Almacene los reactivos de PCR y los productos o servicios de PCR por separado.Alícuota.Guarde los tubos, las puntas o las gradillas de PCR por separado.No despegue el tinte de la ventana del tubo al aire libre.Simplemente use su mezclador principal actual y agregue la matriz al final.Entrena a otros.
Mascuch SJ, Fakhretaha-Aval S, Bowman JC, Ma MTH, Thomas G, Bommarius B, Ito C, Zhao L, Newnam GP, Matange KR, Thapa HR, Barlow B, Donegan RK, Nguyen NA, Saccuzzo EG, Obianyor KT, Karunakaran SK, P llet P., Rothschild-Mancinelli B., Mestre-Fos S., Gut-Metzler R., Bryksin AV, Petrov AS, Hazell M., Ibberson KB, Penev PI , Mannino R.G., Lam V.A., Garcia A.J., Kubanek D. , Agarwal V., Hud N.V., Glass J.B., Williams L.D., Lieberman R.L. Maskuh S.J. et al. JBiolChem. 2020-11-13;295(46):15438-15453. doi: 10.1074/jbc.RA120.015434. Publicado en línea tres de septiembre positivo, 2020 JBiolChem. 2020 PMID: 32883809 Artículo de PMC gratis.
La optimización de PCR requiere un delicado equilibrio entre la apariencia de amplificar productos específicos y vencer la producción de productos no específicos. El objetivo de este estudio fue ayudar a evaluar qué parámetros afectan el funcionamiento y la especificidad de la amplificación de ADN.
Un método para laboratorios universitarios por SARS-CoV-2 conduce a kits de estudio RT-qPCR.
Evite problemas de secuenciación.Compruebe la homología del cebador.Juego para cualquier principiante T m.Terminar con G o C.No olvide incluir espaciadores con respecto a la clonación/ensamblaje de enzimas de restricción isotérmicas.Mantenga una concentración de imprimación equilibrada y saludable.
Mascuch SJ, Fakhretaha-Aval S, Bowman JC, Ma MTH, Thomas G, Bommarius B, Ito C, Zhao L, Newnam GP, Matange KR, Thapa HR, Barlow B, Donegan RK, Nguyen NA, Saccuzzo EG, Obianyor KT, Karunakaran SK, Pollet P., Rothschild-Mancinelli B., Mestre-Fos S., Gut-Metzler R., Bryksin AV, Petrov AS, Hazell M ., Ibberson KB, Penev PI, Mannino RG, Lam VA, García AJ, Kubanek DM , Agarwal V., Khad N.V., Glass J.B., Williams LD, Lieberman R.L. Maskuh S.J. Igualdad al. medRxiv. 1 de septiembre de 2020: 2020.07.29.20163949. doi: 10.1101/2020.07.29.20163949. Formulario. medRxiv. 2020 PMID: 32766604 Artículo de PMC gratis. Actualizar.
Kenneth H. Roux
Aprobado
La herramienta de reparación ASR Pro es la solución para una PC con Windows que funciona lentamente, tiene problemas de registro o está infectada con malware. Esta herramienta poderosa y fácil de usar puede diagnosticar y reparar rápidamente su PC, aumentando el rendimiento, optimizando la memoria y mejorando la seguridad en el proceso. No sufra más por una computadora lenta: ¡pruebe ASR Pro hoy!
La guía posterior se puede utilizar para reparar reacciones de PCR. Use nuestra computadora Tm para experimentar con los procedimientos y haga clic aquí para optimizar sus buenos puntos de ajuste.
Ver
Causa posible
Solución
Error de secuencia
Pomerasa de bajo detalle
Elija una polimerasa de mayor fidelidad, como las ADN polimerasas Q5® (NEB n.° M0491), Phusion® (NEB n.° M0530)
condiciones no óptimas
Reduce el número de bucles.
Reducir el tiempo de extensión
Reducir la concentración de
Mg en la reacción
Concentraciones de nucleótidos desequilibradas
Cree mezclas de desoxinucleótidos naturales
El ADN de la plantilla aún podría estar dañado
Comience con una plantilla más reciente
Intente reconstruir la plantilla de ADN con PreCR®Repair Mix (NEB #M0309)
Siempre limite el tiempo de bronceado UV al analizar o cortar el producto de PCR del gel.
La serie de televisión solicitada puede ser peligrosa para algún anfitrión
Clonar a un vector enorme sin expresiones
Utilice vectores de clonación distintivos con bajo número de copias.
Tamaño de artículo no válido
Temperatura de precalentamiento incorrecta
Recalcule los valores federales de Tm utilizando la calculadora NEB Tm
Error de carga
Asegúrese de que los cebadores tengan algunas fabulosas regiones complementarias adicionales en el ADN del diseño web principal.
Concentración de Mg incorrecta
Ajuste la centralización de
Mg en pasos de 0,2-1 mM
Contaminación por nucleasa
Repita una nueva reacción con soluciones frescas.
Sin productos
Temperatura de precalentamiento incorrecta
Recalcular aumentos de 101 Tm utilizando la calculadora NEB Tm
Pruebe, diría, la pendiente de la temperatura de recocido a partir de 5 °C por debajo del punto Tm inferior junto con el par de cebadores.
Delirio del gobierno
Consulte la documentación del producto para obtener un diseño 101 superior.
Asegúrese de que los cebadores se ejecuten absolutamente y no se complementen entre sí durante y entre sí.
Expandir llamada
Mal gobierno federal que puede ser específico
Asegúrese incuestionablemente de que los oligonucleótidos se complementen entre sí para adaptarse al orden correcto.
Concentración de imprimación insuficiente
El reconocimiento de cebadores se puede escalar dentro del rango importante de 0,05-1 µM. Consulte la documentación específica del producto para conocer las condiciones ideales.
Falta el componente de seguimiento
Configuración de emoción repetida
Condiciones de reacción subóptimas
Optimice la concentración de Mg durante la prueba en pasos de 0,2-1 milímetros
Agite bien la solución de Mg y solicítela antes de comenzar la reacción.
Optimice a menudo la temperatura de recocido probando el gradiente de frío o recociendo 5 °C por debajo de la Tm inferior particular del par de imprimación de pintura.
Plantilla de diseño de baja calidad
Análisis de ADN por electroforesis de relleno antes y después de la incubación en Mg
Compruebe la proporción de ADN de la plantilla 260/280.
Presencia del inhibidor a lo largo de cada reacción
Purificación adicional de la matriz original simplemente por precipitación con alcohol, diálisis en gotas o kit de diferenciación especializado.
Reducir el tamaño de la muestra
No hay suficientes bucles
Repita la reacción con otros bucles.
Programación incorrecta del termociclador de invierno
Consulte el horario, consulte la hora principal con la temperatura.
Temperatura de parada variable
Calibración de la unidad HVAC
Contaminación de los recipientes de reacción o soluciones
Colocar en autoclave los tubos de reacción antes de las operaciones para eliminar los inhibidores biológicos.
Prepare nuevas selecciones o utilice innovadores reactivos e incluso tubos.
Modelo complejo
Utilice Q5 de alta fidelidad (NEB n.º M0491), conocido simultáneamente como polimerasas de ADN OneTaq® (NEB n.º M0480)
