Table of Contents
Одобрено
Иногда ваша система может отображать сообщение о том, что комбинация ДНК подвержена ошибкам. Причин конкретной проблемы может быть много.Определение: вызванное повреждением ДНК обновление с одноцепочечными разрывами непосредственно в ДНК с чрезвычайно высокой молекулярной массой после копирования с использованием специальной ДНК-полимеразы или репликации, разработанной для вставки каждого конкретного нуклеотида путем простого повреждения.
Функция переноса (TLS) использует полимеразы низкой точности, которые будут реплицировать ДНК, которая была разорвана в прошлом, способом, который почти наверняка содержит ошибки. Регуляторные механизмы, защищающие мутагенез, связанный с at, неизвестны; тлс. Однако все эти недавние исследования предполагают, что PCNA-связывающий белок Spartan играет роль в подавлении мутагенеза, вызванного повреждением. Здесь мы с невестой показываем, что Spartan пагубно влияет на склонный к ошибкам TLS, который зависит от La extra pold3, этой субъединицы нашей репликативной ДНК-полимеразы Pol γ. Мы утверждаем, что наиболее важная предполагаемая таргетная цинковая металлопротеаза SprT Spartan, обнаруженная в генах, взаимодействует непосредственно с POLD3 и обеспечивает подавление связанного с ней мутагенеза, вызванного повреждением. Истощение Spartan приводит к образованию комплекса POLD3 с Rev1 и подверженной ошибкам TLS-полимеразе ζ pol, усиливая мутагенез на основе POLD3, Rev1 ζ и pol. Эти результаты показывают, что Spartan отрицательно контролируют кнопки Rev1/Pol-β-зависимой функции TLS в pold3, раскрывая ранее нераспознанный регуляторный шаг, расположенный в подверженном ошибкам TLS.
Взаимодействие сайта SprT с γ-субъединицей ДНК-полимеразы POLD3
Чтобы изучить, как спартанский мир SprT может быть вовлечен в подавление тяжелых мутаций, мы впервые обнаружили что их белки могут взаимодействовать in vivo. После того, как сайты E112A дикого типа, помеченные pro sprt, с 3xFlag и двумя сигналами атомной локализации, были стабильно экспрессированы, наши отношения очистили все связанные белки с помощью иммунопреципитации против Flag (дополнительная фигура S2A) и обсудили большинство белков, осажденных в массе. спектрометрия. Пептиды, соответствующие трем репликативным субъединицам полимеразы Pol γ, в значительной степени POLD1, POLD2, POLD3 и POLD4, были идентифицированы в иммунопреципитате E112A SprT, но интересно знать, что это не совершенно новый результат дикого типа (дополнительный Спрт Таблица S1). Пул, содержащий комплексы SprT E112A Pol γ в этом скрининге, впоследствии был подтвержден иммуноблоттингом с областью антител против POLD1, POLD2 и, следовательно, POLD3 (фиг. 2A).
Длина склонных к ошибкам фрагментов ДНК, синтезированных в ТГФ-шунте
Всего 394 продукта ТГФ-шунта и 456 контрольных репликаций плазменных дисплеев продукты рассчитывали с помощью секвенирования ДНК. Как и ожидалось, практически все события TLS произошли в A (243/394; 62%) и, возможно, C (80/394; 20%) при анализе всех повреждений включения. Т-образная установка имела место в 18% заявлений (71/394). Одна из 18 мутаций была обнаружена относительно нижестоящей области, пройдя в среднем 34, не говоря уже о 1529 нуклеотидах от некоторых ТГФ (рис. 2А; таблица 1). Эти «автостопные» вариации были по существу сосредоточены в пределах части примерно из 220 нуклеотидов, непосредственно окружающей очаг поражения. Хотя среди 456 плазмид под сетью повреждений было обнаружено 11 форм, их распределение могло значительно отличаться при использовании всех продуктов TLS. Мутации в контролируемых плазмидах случайным образом распределяются по всей области секвенирования человека, при этом ни одна из 11 мутаций не развивается в пределах основных 220 нуклеотидов, в отличие от примерно 40% средств обхода ТГФ (p = 0,0045, тот же точный тест Фишера). Скорость была связана с мутацией в следующей области из 230 нуклеотидов – сайт THF уже составлял 8,1 x 10-5 нуклеотидов для каждого (таблица 2). Это примерно в 300 000 временных интервалов превышает скорость полного гена многих вариаций пекарских дрожжей и почти реально близка к указанной скорости ошибки при копировании интактной ДНК с фильтрованным Polζ in vitro (5,6 × 10–4, [28]). Частота, связанная с вариантами, непосредственно предшествующими ране онлайн-бизнеса, не отличалась от большинства контрольных плазмид (рис. 2А) из-за конкретной идеи о том, что этот сайт замечательного мутагенеза происходит из-за подверженного ошибкам синтеза ДНК, инициированного на этой странице раны. Частота версий ниже самого поражения была низкой на уровне истории, так как их расстояние от места поражения превышало двести нуклеотидов. В результате типы адаптаций в этих удаленных регионах были чрезвычайно сходны с таковыми в ответственных за них C†’T плазмидах (в основном -10-ые переходы и делеции). На неясном, в районе 220 британских нефтеперерабатывающих заводов, прилегающих к участку нарушения, был полностью обнаружен один переход C-T и -1 без посещающего сдвига рамки (рис.
Ген Cerevisiae saccharomyces кодирует ДНК-κ-полимеразу rad30. U человека имеет два гомолога Rad30. Один (RAD30A/POLH) уже выделен и признан дефектным по отношению к людям с вариантом пигментной ксеродермы. Здесь мы сообщаем об экспериментах, представляя этому второму человеческому гомологу (RAD30B) плюс коды новой ДНК-полимеразы, которую мы называем polι. polγ определенно является типичным ферментом доставки, который был бы чрезвычайно подвержен ошибкам при репликации неповрежденной ДНК. Производительность Oug C пострадала из-за типичной частоты ошибок, связанной с ≥1‰⋅10‰2. Тем не менее, наше исследование выявило поразительную асимметрию в частоте пропусков зажигания схемы А в дополнение к B и T. Модель А, например, была воспроизведена с наилучшей точностью, как и пропуски зажигания G, A или C, которые происходили при ч, связанный по значению, чтобы помочь вам â ˆ¼1‰ × 10‰4 2‰Ã—‰10‰4 bis. Наоборот, некоторые ошибки произошли с точным шаблоном T, где-то неправильное включение G было действительно более предпочтительным 3: 1 при вашем текущем идеальном соотношении нуклеотидов, а одно конкретное, неправильное включение Trat t произошло с хорошей твердой частотой 6,7–10– 1. . Результаты. Они демонстрируют, что polγ действительно является одной из наиболее подверженных ошибкам эукариотических полимераз, раскрытых на сегодняшний день, и демонстрирует хороший необычный спектр неправильного включения, который происходит в лабораторных условиях.
ДНК-тест-полимераза
). Показано, что анализ, используемый с маркой 5″-CTCGTCAGCATCTTCATCATACAGTCAGTG-3″, представляет собой высококачественную, твердую, интактную модель. Невероятный 30-член, показывающий тип фотопродукта димера Cys-Syn человека (CPD) или (6-4), расположенного в подчеркнутом виде в естественном виде, был химически синтезирован, как описано ранее (Murata de plus. 1990; Iwai et al. 1996). . AP-T (5”-CTCGTCAGCATCTXCATCATACAGTCAGTG-3”) из X, обозначающего базовый сайт, получали, как описано (Fujiwara and Alabama. 1999). Обе модели модифицированы AAF, AAF-A (5″-CTTCTCTCACCTCTAGTCTCCTACACACTCAATC-3″) и AAF-T (5″-CTCTTCACCTCATGTCTCCTACACACTCAATC-3″) Я получил путем обработки все еще действующих 30-меров N-ацетокси-AAF, как указано (van Vuuren et al. 1993), и моей использованной цисплатиновой модели (5-CTCGTCACCTCGGTCTCCTACAGTCAGTG-3-3 с GG, расположенным стопкой в подчеркнутом пространстве). обычно готовится, как описано (Fujiwara and Alabama. 1999). Чистоту подвергнутых стрессу матриц проверяли, наблюдая за большинством побочных продуктов ферментативным методом Кленова. грунтовки связанные с разной длиной и последовательностью, придавались 5′-концу полинуклеотидкиназой Т4 и [γ-32P]АТФ и дополнительно отжигались с матрицей в молярном процентном отношении 1:1. Стандартные реакции (10 мкл) в надежном месте 40 мМ Tris-HCl (pH 8,0), Mm MgCl2, по 100 мкМ каждый из четырех dNTP, 10 мМ DTT, несколько мкг/мл BSA любого типа, 60,2 мМ KCl, 0,5% глицерин, 60 нм. грунтовка веб-шаблона и некоторое количество хим. После 15-минутной инкубации при 37°С реакция остается нажатой без особых раздумий с Суммирование десяти мкл формамида проводят простым кипячением. Продукты подвергали позитивному электрофорезу в жидком растворе 20% полиакриламида/7 М мочевины с последующей авторадиографией.
Нас, безусловно, будет интересовать, как клетки обнаруживают свое проникновение полимераз репликативной вилки, имея при этом низкую точность, поскольку неправильное обращение с ними приводит к нестабильности генома. В трансфузионном синтезе (TLS) склонные к ошибкам полимеразы TLS привлекаются к веб-страницам с проблемами ДНК, чтобы обеспечить большее удлинение цепи и износ, чем ДНК, которая блокирует рост реплисом. coli в качестве модельной программы, точное программное обеспечение, которое мы показали, может реконструировать трансфузионный синтез обратно в участок повреждения ДНК, специфичный для участка, и обмен следовыми полимеразами между персонализированными ДНК. Используя этот подход, кто-то представил, что полимеразы Pol IV и Pol II, участвующие в передаче, должны быть способны связывать бета-удержание процессивности, позволяя быстро обойти повреждение. В современной карьере мы продлеваем это время на правильно восстановленные микробные реплисомы и живые клетки в старшей школе.
Штаммы, рост, клетки и лечение повреждений ДНК
Генетический ряд, связанный с S. islandicus E233S Et (deng al.2009 ). . . был получен из инновационного изолята S. islandicus (Contursi rey15a et al., 2006). Штамм E233S и, следовательно, его фактическая делеция каждого ответвления гена ДНК-полимеразы (дополнительная таблица S1) появлялись в проталкивающей среде SCV (базовая среда, составленная из 0,2% сахарозы, 0,2% химикатов казамино и 1% дезинфицирующего раствора) при 78°C. (Deng al et., 2009), в этом случае урацил добавляли до концентрации более 20 мкг/мл. Стрессы и штаммы pSeSD_dpo2/E233S и pSeSD/E233S были благородны в среде ACV, в которой сахароза была заменена D-арабинозой примерно на том же уровне содержания (Peng et al., 2012).
г.
